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植物熒光活體成像技術及其應用
發布時間： 2021-06-28 點擊次數： 5256次植物活體成像技術能夠在不破壞植物組織的前提下，利用一套非常靈敏的光學檢測儀器，直接監控活體植物的細胞活動、光合作用和基因行為。其中應用*泛的熒光活體成像技術，由于操作簡單、結果直觀、靈敏度高等特點，在植物光合機理、突變體篩選、抗逆基因與表型、生理節律與發育等研究中都有大量的應用。
熒光活體成像技術又可以分為兩大類：
一是穩態熒光成像，主要針對GFP等熒光蛋白和DAPI等熒光染料
二是瞬態熒光成像，代表技術為脈沖調制式（Pulse Amplitude Modulated，PAM）葉綠素熒光成像技術，主要用于葉綠素熒光動力學曲線的成像測量，反映植物光合能力、光系統狀態、電子傳遞鏈運行狀況等。
需要注意的是，一般的穩態熒光成像技術也可以測量葉綠素熒光，但只能測量穩定狀態下的葉綠素熒光。而葉綠素熒光的動態變化是與光合電子傳遞狀態密切相關的，只有脈沖調制式葉綠素熒光成像技術才能進行葉綠素熒光動力學曲線測量，進而獲取大量與植物光合機理相關的參數與成像圖。目前國際上僅有FluorCam熒光成像技術將穩態熒光成像技術與脈沖調制式葉綠素熒光成像技術融于一體，是真正功能全面的植物熒光活體成像技術，能夠在一臺儀器上實現GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等熒光蛋白成像、DAPI等熒光染料成像、脈沖調制式葉綠素熒光成像以及NDVI反射光譜成像分析功能。同時，除了植物樣品外，FluorCam熒光成像技術也可以進行藻類、珊瑚共生體、菌落乃至動物的熒光成像分析。
文獻案例一：抗病毒基因研究
法國國家農業科學研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究團隊一直致力于馬鈴薯y病毒組的抗病基因研究。這一病毒組中包括蕪菁花葉病毒(TuMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、三葉草黃脈病毒(ClYVV)等重要的農作物病毒。這方面研究的難點在于如何直觀、定量地測量病毒在植物樣品上的分布與積累。FluorCam熒光成像技術的出現解決了這一難題。法國國家農業科學研究院利用FluorCam封閉式熒光成像系統，從2015年起發表了一系列相關文章，研究方向包括病毒的TOR信號調控、跨物種合成eIF4E1等位基因獲得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編輯技術模仿eIF4E自然多態性與病毒抗性的關系、擬南芥敲除eIF4E1獲得ClYVV抗性但又與TuMV的敏感性相關等。這些研究中，FluorCam熒光成像技術提供了關鍵的GFP活體成像圖，定量分析感染面積與病毒積累量，從而直觀地反映了不同基因功能對擬南芥病毒抗性的影響。同時，葉綠素熒光成像則反映病毒對光合系統的損傷，可以同步提供植物的光合表型信息。
美國田納西大學、突尼斯El Manar大學、法國艾克斯-馬賽大學等科研機構也同樣使用FluorCam熒光成像技術的RFP、GFP活體成像功能進行了TuMV、黃單孢菌屬等致病菌的調控機理研究。
參考文獻：
- Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347
- Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750
- Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13
- Ouibrahim L, et al. 2015. Potyviruses differ in their requirement for TOR signaling. Journal of General Virology 96, 2898-2903
- Liu W. et al. 2014. Synthetic TAL effectors for targeted enhancement of transgene expression in plants. Plant Biotechnology Journal 12, 436–446
- Abdelkefi H, et al. 2018. Guanosine tetraphosphate modulates salicylic acid signalling and the resistance of Arabidopsis thaliana to Turnip mosaic virus. Molecular Plant Pathology 19(3): 634-646
文獻案例二：珊瑚共生體的生態功能研究
珊瑚是腔腸動物珊瑚蟲與蟲黃藻組成的共生體。葡萄牙阿威羅大學與美國喬治亞大學合作研究珊瑚共生體的葉綠素熒光成像——反映光合能力，NDVI反射光譜指數成像——反映葉綠素的分布及濃度變化，GFPs（綠色熒光蛋白類似蛋白）成像——珊瑚蟲本身具備的蛋白，但其意義尚不明確。目前只有FluorCam熒光成像技術可以同步進行這三種成像分析。研究結果不但再次證實了珊瑚本身具備*的光合作用能力，而且發現葉綠素和GFPs的分布會隨著珊瑚蟲的膨脹收縮而同步變化，同時兩者間表現出顯著的分布差異。葉綠素濃度（NDVI）在珊瑚口盤處減少，而GFPs則增加。而葉綠素熒光參數最大光化學效率Fv/Fm的分布則沒有與葉綠素濃度和GFPs的分布表現出相關性。
參考文獻：
Leal MC, et al. 2015. Concurrent imaging of chlorophyll ?uorescence, Chlorophyll a content and green ?uorescent proteins-like proteins of symbiotic cnidarians. Marine Ecology, DOI: 10.1111/maec.12164
文獻案例三：植物內生細菌開發
很多植物內生細菌（plant growth-promoting endophytic bacteria，PGPEB）對植物的生長都具有促進作用，但如何有效利用內生細菌，乃至將其開發成一種新型肥料，就必須探索出一整套制劑配方策略。哥倫比亞農業研究公司與德國比勒菲爾德應用科學大學、萊布尼茨蔬菜和觀賞作物研究所（IGZ）合作，開發一種植物生長促進內生細菌Kosakonia radicincitans DSM16656的制劑配方策略。這種內生細菌可以通過蘿卜根系形成內生后，會顯著促進蘿卜的生長。為了能夠直觀檢測不同配方處理后細菌在蘿卜根系的活力，研究者直接將不同處理后帶GFP標記的細菌液滴與蘿卜根系放置到FluorCam開放式熒光成像系統中，進行GFP成像成像分析。從GFP熒光強度上即可直接反映不同處理后內生細菌的活性，從而優化最佳的制劑配方策略。
參考文獻：
Barrera MC, et al. 2020. Formulating bacterial endophyte: Pre-conditioning of cells and the encapsulation in amidated pectin beads. Biotechnology Reports 26: e0046
北京易科泰生態技術公司提供植物活體成像研究全面技術方案：
- FluorCam葉綠素熒光及熒光蛋白活體成像系統
- FluorCam多光譜熒光成像系統
- Thermo-RGB紅外熱成像技術
- Specim高光譜成像測量技術
- PhenoPlot輕便型作物植物表型成像分析系統
- PhenoTron®-HF植物表型與種質成像分析平臺
- PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺